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  • 021-64055267
    咨询热线:
    关于怎样使用血管内皮细胞生长因子 (VEGF)ELISA试剂盒的明细
    2017-08-25

    本试剂仅供研究使用
    目的:本试剂盒用于测定人血清,细胞上清及相关液体样本中血管内皮细胞生长因子(VEGF)的含量。
    实验原理:
    ? 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人血管内皮细胞生长因子(VEGF)水平。用纯化的人血管内皮细胞生长因子(VEGF)抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入血管内皮细胞生长因子(VEGF),再与HRP标记的血管内皮细胞生长因子(VEGF)抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成*终的黄色。颜色的深浅和样品中的血管内皮细胞生长因子(VEGF)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中人血管内皮细胞生长因子(VEGF)浓度。
    试剂盒组成:
    试剂盒组成48孔配置96孔配置保存
    说明书1份1份
    封板膜2片(48)2片(96)
    密封袋1个1个
    酶标包被板1×481×962-8℃保存
    标准品:1350pg/ml0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存
    标准品稀释液1.5ml×1瓶1.5ml×1瓶2-8℃保存
    酶标试剂3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存
    样品稀释液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存
    显色剂A液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存
    显色剂B液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存
    终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存
    浓缩洗涤?#28023;?0ml×20倍)×1瓶(20ml×30倍)×1瓶2-8℃保存

    样本处理及要求:
    1. 血清:室温血液自然凝固10-20分钟,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如出现沉淀,应再次离心。
    2. 血浆:应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂,混合10-20分钟后,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应该再次离心。
    3. 尿?#28023;?#29992;无菌管收集,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
    4. 细胞培养上清:检测?#32622;?#24615;的成份?#20445;?#29992;无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。检测细胞内的成份?#20445;?#29992;PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬?#28023;?#32454;胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融,以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
    5. 组织标本:切割标本后,称取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS(PH7.4),用?#27490;?#25110;匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。分装后?#29615;?#24453;检测,其余冷冻备用。
    6. 标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融.
    7. 不能检测含NaN3的样品,因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。
    操作步骤
    1. 标准品的稀释与加样:在酶标包被板上设标准品孔10孔,在第一、第二孔中分别加标准品100μl,然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl,混匀;然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第?#30446;祝?#20877;在第三、第?#30446;?#20998;别加标准品稀释液50μl,混匀;然后在第三孔和第?#30446;?#20013;先各取50μl弃掉,再各取50μl分别加到第五、第六孔中,再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul,混匀;混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl,混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl,混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。(稀释后各?#20934;?#26679;量都为50μl,浓度分别为900pg/ml,600pg/ml ,300 pg/ml,150 pg/ml,75 pg/ml)。
    2. 加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl,然后再加待测样品10μl(样品*终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混?#21462;?br>3. 温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
    4. 配?#28023;?#23558;30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T的20倍)倍稀释后备用。
    5. 洗涤?#30418;?#24515;揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每?#20934;?#28385;洗涤?#28023;?#38745;置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。
    6. ?#29992;福?#27599;?#20934;?#20837;酶标试剂50μl,空白孔除外。
    7. 温育:操作同3。
    8. 洗涤:操作同5。
    9. 显色:每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15分钟.?
    10. 终止:每?#20934;?#32456;止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。
    11. 测定:以空白空调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。
    注意事项:
    1. 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用,酶标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存。
    2. 浓洗涤液可能会有结晶析出,稀释时可在水浴中加温助溶,洗涤时不影响结果。
    3. 各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免试验误差。一次加样时间**控制在5分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。
    4. 请每次测定的同时做标准曲线,**做?#32431;住?#22914;标本中待测物质含量过高(样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值),请先用样品稀释液稀释一定倍数(n倍)后再测定,计算时请**乘以总稀释倍数(×n×5)。
    5. 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污?#23613;?br>6. 底物请避光保存。
    7. ?#32454;?#25353;照说明书的操作进行,试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
    8. 所有样品,洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
    9. 本试剂不同批号组分?#22351;?#28151;用。
    10. 如与英文说明书有异,以英文说明书为准。
    计算:
    以标准物的浓度为横坐标,OD值为纵坐标,????
    在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD??????
    ?#28068;?#26631;准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释??????
    倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标?
    ?????
    ?
    ???????????? (此图仅供参考)
    ?
    准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,?#27425;?#26679;品的实际浓度。?
    试剂盒性能:
    1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.95以上。
    2.批内与批见应分别小于9%和11%
    检测范围:??????????????????????????????????????????????
    30pg/ml-1200pg/ml????????????????????????????????????????
    ????????????????????????????
    保存条件及有效期:
    1.试剂盒保存?#28023;?-8℃。
    2.有效期:6个月


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